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L’un des obstacles à l’utilisation de l’édition de gènes CRISPR-Cas9 en clinique est la possibilité que l’enzyme coupe l’ADN au mauvais endroit. Dans une étude publiée dans Nature le 12 septembre, les chercheurs décrivent une stratégie pour prédire ces mutations non ciblées dans le génome et montrent chez la souris qu’un brin d’ARN guide soigneusement conçu ne produit pas de dérapage détectable.

Une nouvelle stratégie pour prédire des mutations 

L’étude confirme que «vous feriez mieux de vous assurer que vous avez un ARN guide très précis», explique Janet Rossant, biologiste du développement à l’Université de Toronto et à l’Hôpital pour enfants malades qui n’a pas participé à cette recherche. «Cette méthode est une meilleure façon de vérifier la spécificité de l’ARN guide avant de passer aux modèles animaux et, bien sûr, aux humains», ajoute-t-elle.

Selon le coauteur Marcello Maresca, biologiste chez AstraZeneca en Suède, l’un des objectifs à long terme de son entreprise est de pouvoir utiliser la modification génétique thérapeutique pour traiter un certain nombre de maladies humaines. «Cependant, pour réaliser le potentiel des médicaments CRISPR, il faut mettre au point des méthodes permettant de modifier efficacement le gène cible sans aucun effet ailleurs dans le génome», explique-t-il.

Les coupures hors cible peuvent se produire dans un lieu génomique où elles n’ont aucun effet sur l’organisme, ou peuvent perturber les fonctions cellulaires essentielles. En essayant d’anticiper les endroits où Cas9 pourrait se tromper, les chercheurs commencent souvent par des prédictions informatiques, mais celles-ci reposent sur des suppositions sur la manière dont leur ARN guide va lier l’ADN et sur la façon dont Cas9 coupera.

«Il est passionnant de voir une méthode pour définir expérimentalement des cibles, car cette approche manque du biais introduit par nos hypothèses sur ce qui constitue un endroit hors cible», explique Kate O’Connor-Giles, neuroscientifique à l’Université Brown qui n’a pas participé à cette étude.

Plusieurs étapes pour parvenir à mieux utiliser CRISPR-Cas9

Pour développer une méthode permettant de minimiser les effets hors cible, le groupe de Maresca s’est associé à l’équipe de J. Keith Joung, biologiste et pathologiste à l’Université Harvard et au Massachusetts General Hospital. La première partie de l’approche des chercheurs, initialement développée par le groupe Joung et publiée en 2017, se déroule in vitro.

Premièrement, ils cisaillent l’ADN génomique – dans la présente étude, ils ont utilisé des génomes de souris – en morceaux d’environ 300 paires de bases, puis ont fixé une série d’adaptateurs qui circulent dans l’ADN, puis ils introduisent une nucléase Cas9 et dirigent le complexe ARN, qui clive l’ADN circulaire à certains endroits et le linéarise.

Un autre lot de nucléases dégrade l’ADN circulaire restant qui n’a pas été coupé. De cette manière, les chercheurs peuvent séquencer l’ADN linéarisé pour voir où le Cas9 a effectué ses coupes – à la fois intentionnelles et non intentionnelles – et prédire si cet ARN guide conduira à des effets hors cible in vivo.

Plusieurs mutations dans les foies de souris

Pour la deuxième partie de la stratégie développée dans la dernière étude, les auteurs ont testé leur prédiction chez la souris. Lorsqu’ils ont utilisé un ARN guide qu’ils ont trouvé in vitro, ils ont coupé des milliers de points erronés dans le génome, plus de 40% des sites prédits du sous-ensemble qu’ils ont examiné ont également été mutés dans des foies de souris.

L’équipe a également vérifié les points du génome de la souris à partir des expériences in vivo qui avaient été prédites par un calcul comme des sites non ciblés, mais qui n’apparaissaient pas dans leur écran in vitro. Ils n’ont pas détecté de mutations à ces endroits, ce qui signifie que leur méthode in vitro ne leur a probablement pas trompé.

Pour un autre ARN guide où les chercheurs s’attendaient à voir des changements dans des sites cibles, mais ils n’ont identifié aucune mutation détectable in vivo sur aucun des 182 sites prévus.

Une réelle avancée 

«Une réelle avancée est la capacité de détecter des cibles spécifiques à un organisme, plutôt que de compter sur une séquence de génome de référence qui ne reflète pas nécessairement le contexte génétique de l’organisme avec lequel vous travaillez ou, dans le cas d’un contexte clinique sur le patient », explique O’Connor-Giles.

Comme il est possible d’utiliser l’ADN génomique du patient ou de l’organisme pour le dépistage in vitro, les lectures de l’étape de séquençage reflètent les cibles Cas9 dans le génome du sujet.

Une voie à suivre

«Cette étude devrait encourager le développement de traitements in vivo», explique Joung. «Il fournit également un plan ou une voie à suivre important pour savoir comment examiner ces cibles dans le contexte d’un organisme entier ou d’un environnement in vivo.

De plus c’est important car, en particulier à des fins de recherche, cela vous permet d’évaluer si les modifications apportées à une stratégie pour améliorer la spécificité, ont l’effet escompté.

Source : The Scientist